Proizvodi
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR komplet za detekciju 2019-nCoV
Očekivana upotreba
Ovaj komplet se koristi za kvalitativnu detekciju novog koronavirusa (2019-nCoV) korištenjem briseva grla, nazofaringealnih briseva, tekućine bronhoalveolarne lavaže i sputuma. Rezultat detekcije ovog proizvoda služi samo za kliničku referencu i ne smije se koristiti kao jedini dokaz za kliničku dijagnozu i liječenje. Preporučuje se sveobuhvatna analiza stanja u kombinaciji s kliničkim manifestacijama pacijenta i drugim laboratorijskim testovima.
Princip inspekcije
Komplet se zasniva na jednostepenoj RT-PCR tehnologiji. U stvari, geni ORF1ab i N novog koronavirusa (2019-nCoV) iz 2019. godine odabrani su kao ciljne regije amplifikacije. Specifični prajmeri i fluorescentne probe (probe N gena su označene sa FAM, a ORF1ab probe su označene sa HEX) dizajnirani su za detekciju RNK novog tipa koronavirusa iz 2019. godine u uzorcima. Komplet također uključuje endogeni sistem za detekciju interne kontrole (proba gena interne kontrole označena sa CY5) za praćenje procesa prikupljanja uzoraka, amplifikacije RNK i PCR-a, čime se smanjuju lažno negativni rezultati.
Glavne komponente
| Komponente | Volumen(48T/Komplet） |
| RT-PCR reakcijska otopina | 96µl |
| nCOV prajmer TaqMan probemixture (ORF1ab, N gen, RnaseP gen) | 864µl |
| Negativna kontrola | 1500µl |
| nCOV pozitivna kontrola (l ORF1ab N gen) | 1500µl |
Vlastiti reagensi: reagensi za ekstrakciju ili prečišćavanje RNK. Negativna/pozitivna kontrola: Pozitivna kontrola je RNK koja sadrži ciljni fragment, dok je negativna kontrola voda bez nukleinskih kiselina. Tokom upotrebe, trebaju učestvovati u ekstrakciji i trebaju se smatrati zaraznima. S njima treba rukovati i odlagati ih u skladu s relevantnim propisima.
Interni referentni gen je ljudski RnaseP gen.
Uslovi skladištenja i rok trajanja
-20±5℃, izbjegavajte ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje više od 5 puta, važi 6 mjeseci.
Primjenjivi instrument
Sa FAM / HEX / CY5 i drugim višekanalnim fluorescentnim PCR instrumentom.
Zahtjevi za uzorke
1. Primjenjive vrste uzoraka: brisevi grla, nazofaringealni brisevi, tekućina bronhoalveolarne lavaže, sputum.
2. Uzimanje uzoraka (aseptična tehnika)
Faringealni bris: Obrišite krajnike i stražnji zid ždrijela s dva brisa istovremeno, a zatim uronite glavu brisa u epruvetu koja sadrži otopinu za uzorkovanje.
Sputum: Nakon što pacijent duboko kašlje, sakupite iskašljani sputum u epruvetu sa navojnim čepom koja sadrži rastvor za uzorkovanje; tečnost za bronhoalveolarnu lavažu: Uzorkovanje vrše medicinski stručnjaci. 3. Skladištenje i transport uzoraka
Uzorke za izolaciju virusa i testiranje RNK treba testirati što je prije moguće. Uzorci koji se mogu detektovati u roku od 24 sata mogu se čuvati na 4℃; oni koji se ne mogu detektovati u roku od 24 sata
Sati treba čuvati na -70℃ ili niže (ako nema uslova skladištenja od -70℃, treba ih čuvati
privremeno uskladišteno na -20℃ u hladnjaku). Uzorke treba izbjegavati ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje tokom transporta. Uzorke treba poslati u laboratoriju što je prije moguće nakon prikupljanja. Ako je potrebno transportovati uzorke na velike udaljenosti, preporučuje se skladištenje u suhom ledu.
Metode ispitivanja
1 Obrada uzorka i ekstrakcija RNK (prostor za obradu uzorka)
Preporučuje se uzimanje 200 μl tekućeg uzorka za ekstrakciju RNK. Za povezane korake ekstrakcije, pogledajte upute komercijalnih kompleta za ekstrakciju RNK. I negativni i negativni
Kontrole u ovom kompletu su bile uključene u ekstrakciju.
2 Priprema PCR reagensa (prostor za pripremu reagensa)
2.1 Izvadite sve komponente iz kompleta, odmrznite ih i promiješajte na sobnoj temperaturi. Centrifugirajte na 8.000 o/min nekoliko sekundi prije upotrebe; izračunajte potrebnu količinu reagensa i reakcijski sistem pripremite kao što je prikazano u sljedećoj tabeli:
| Komponente | N porcija (sistem od 25 µl) |
| nCOV prajmer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcijska otopina | 2 µl × N |
| *N = broj testiranih uzoraka + 1 (negativna kontrola) + 1 (nCOVpozitivna kontrola) | |
2.2 Nakon temeljitog miješanja komponenti, centrifugirajte kratko vrijeme kako bi sva tekućina sa stijenke epruvete pala na dno epruvete, a zatim alikvotirajte 20 µl sistema za amplifikaciju u PCR epruvetu.
3 Uzorkovanje (prostor za pripremu uzoraka)
Nakon ekstrakcije, dodajte 5 μl negativne i pozitivne kontrole. RNK uzorka koji se testira dodaje se u PCR reakcijsku epruvetu.
Čvrsto zatvorite epruvetu i centrifugirajte je na 8.000 okretaja u minuti nekoliko sekundi prije nego što je prenesete u područje detekcije amplifikacije.
4 PCR amplifikacija (amplificirano područje detekcije)
4.1 Postavite reakcijsku epruvetu u ćeliju za uzorak instrumenta i podesite parametre na sljedeći način:
| pozornica | Bicikl broj | Temperatura(°C) | Vrijeme | kolekcijastranica |
| Obrnutotranskripcija | 1 | 42 | 10 minuta | - |
| Predenaturacijan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Bicikl | 45 | 95 | 15 sekundi | - |
| 60 | 30-ih | prikupljanje podataka |
Odabir kanala za detekciju instrumenta: Odaberite FAM, HEX, CY5 kanal za fluorescentni signal. Za referentni fluorescentni NONE, molimo vas da ne birate ROX.
5 Analiza rezultata (Molimo pogledajte eksperimentalne upute svakog instrumenta za podešavanje)
Nakon reakcije, sačuvajte rezultate. Nakon analize, prilagodite početnu vrijednost, završnu vrijednost i graničnu vrijednost osnovne linije prema slici (korisnik može prilagoditi prema stvarnoj situaciji, početna vrijednost se može postaviti na 3~15, a završna vrijednost na 5~20, podešavanje) u logaritamskom grafiku. Na pragu prozora, linija praga je u logaritamskoj fazi, a krivulja amplifikacije negativne kontrole je ravna linija ili ispod linije praga.
6. Kontrola kvaliteta (u test je uključena i proceduralna kontrola). Negativna kontrola: Nema očigledne krivulje amplifikacije za FAM, HEX, CY5 kanale detekcije.
COV pozitivna kontrola: očigledna krivulja amplifikacije FAM i HEX kanala za detekciju, Ct vrijednost ≤ 32, ali nema krivulje amplifikacije CY5 kanala;
Gore navedeni zahtjevi moraju biti ispunjeni istovremeno u istom eksperimentu; u suprotnom, eksperiment je nevažeći i potrebno ga je ponoviti.
7 Utvrđivanje rezultata.
7.1 Ako nema krivulje amplifikacije ili je Ct vrijednost > 40 u FAM i HEX kanalima testiranog uzorka, a postoji krivulja amplifikacije u CY5 kanalu, može se procijeniti da u uzorku nema RNK novog koronavirusa iz 2019. (2019-nCoV);
.2 Ako testni uzorak ima očite krivulje amplifikacije u FAM i HEX kanalima, a Ct vrijednost je ≤40, može se procijeniti da je uzorak pozitivan na novi koronavirus iz 2019. (2019-nCoV).
7.3 Ako testni uzorak ima jasnu krivulju amplifikacije samo u jednom kanalu FAM-a ili HEX-a, a Ct vrijednost je ≤40, a nema krivulje amplifikacije u drugom kanalu, rezultate je potrebno ponovo testirati. Ako su rezultati ponovnog testiranja konzistentni, uzorak se može smatrati pozitivnim za novi test.
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Ako je rezultat ponovnog testiranja negativan, može se procijeniti da je uzorak negativan na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivna vrijednost procjene
Metoda ROC krive se koristi za određivanje referentne CT vrijednosti kompleta, a referentna vrijednost interne kontrole je 40.
Interpretacija rezultata testa
1. Svaki eksperiment treba testirati na negativne i pozitivne kontrole. Rezultati testa mogu se utvrditi samo kada kontrole ispunjavaju zahtjeve kontrole kvalitete.
2. Kada su FAM i HEX detekcijski kanali pozitivni, rezultat sa CY5 kanala (kanal interne kontrole) može biti negativan zbog sistemske konkurencije.
3. Kada je rezultat interne kontrole negativan, a kanali za detekciju FAM i HEX u epruveti su također negativni, to znači da je sistem onemogućen ili da je operacija pogrešna, odnosno da je test nevažeći. Stoga je potrebno ponovo testirati uzorke.
