Proizvodi
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR komplet za detekciju za 2019-nCoV
Očekivana upotreba
Ovaj komplet se koristi za kvalitativno otkrivanje novog korona virusa (2019-nCoV) pomoću briseva grla, nazofaringealnih briseva, tekućine iz bronhoalveolarnog ispiranja, sputuma. Rezultat detekcije ovog proizvoda je samo za kliničku referencu i ne bi se trebao koristiti kao jedini dokaz za kliničku dijagnozu i liječenje. Preporučuje se sveobuhvatna analiza stanja u kombinaciji s kliničkim manifestacijama pacijenta i drugim laboratorijskim testovima.
Princip inspekcije
Komplet je baziran na RT-PCR tehnologiji u jednom koraku.Zapravo, ORF1ab i N geni za novi koronavirus (2019-nCoV) iz 2019. odabrani su kao ciljne regije amplifikacije.Specifični prajmeri i fluorescentne sonde (N genske sonde su označene sa FAM, a ORF1ab sonde su označene sa HEX) dizajnirani su za otkrivanje 2019 novog tipa RNK koronavirusa u uzorcima.Komplet takođe uključuje sistem za detekciju endogene interne kontrole (genska sonda interne kontrole označena sa CY5) za praćenje procesa prikupljanja uzoraka, RNA i PCR amplifikacije, čime se smanjuju lažno negativni rezultati.
Glavne komponente
| Komponente | Volume（48T/Kit） |
| RT-PCR reakcijski rastvor | 96µl |
| nCOV prajmer TaqMan probemixture (ORF1ab, N gen, RnaseP gen) | 864µl |
| Negativna kontrola | 1500µl |
| nCOV pozitivna kontrola (l ORF1ab N gen) | 1500µl |
Vlastiti reagensi: reagensi za ekstrakciju ili prečišćavanje RNK.Negativna/pozitivna kontrola: Pozitivna kontrola je RNK koja sadrži ciljni fragment, dok je negativna kontrola voda bez nukleinske kiseline.Tokom upotrebe, treba da učestvuju u ekstrakciji i treba ih smatrati zaraznim.Njima treba rukovati i odlagati ih u skladu sa relevantnim propisima.
Interni referentni gen je ljudski RnaseP gen.
Uslovi skladištenja i rok trajanja
-20±5℃, izbegavajte ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje više od 5 puta, važi 6 meseci.
Primjenjivi instrument
Sa FAM / HEX / CY5 i drugim višekanalnim fluorescentnim PCR instrumentom.
Zahtjevi uzorka
1. Primjenjivi tipovi uzoraka: brisevi grla, nazofaringealni brisevi, tekućina za bronhoalveolarno ispiranje, sputum.
2. Sakupljanje uzoraka (aseptična tehnika)
Bris ždrijela: obrišite krajnike i stražnji zid ždrijela s dva štapića istovremeno, a zatim uronite glavu brisa u epruvetu koja sadrži otopinu za uzorkovanje
Sputum: Nakon što pacijent duboko zakašlja, sakupite iskašljani sputum u epruvetu sa navojnim poklopcem koja sadrži rastvor za uzorkovanje;Bronhoalveolarna tečnost za ispiranje: Uzimanje uzoraka od strane medicinskih stručnjaka.3. Čuvanje i transport uzoraka
Uzorke za izolaciju virusa i RNA testiranje treba testirati što je prije moguće.Uzorci koji se mogu otkriti u roku od 24 sata mogu se čuvati na 4℃;oni koji se ne mogu otkriti unutar 24
sati treba čuvati na -70 ℃ ili ispod (ako nema uslova skladištenja od -70 ℃, treba ih
privremeno uskladišteno na -20℃ frižider).Uzorci treba izbjegavati ponovno zamrzavanje i odmrzavanje tokom transporta.Uzorke treba poslati u laboratoriju što je prije moguće nakon uzimanja.Ako uzorke treba transportovati na velike udaljenosti, preporučuje se skladištenje na suvom ledu.
Test Methods
1 Obrada uzorka i ekstrakcija RNK (područje obrade uzoraka)
Preporučuje se uzimanje 200 μl tečnog uzorka za ekstrakciju RNK.Za povezane korake ekstrakcije pogledajte upute komercijalnih kompleta za ekstrakciju RNK.I negativne i negativne
kontrole u ovom kompletu bile su uključene u ekstrakciju.
2 Priprema reagensa za PCR (područje za pripremu reagensa)
2.1 Uklonite sve komponente iz kompleta i odmrznite i promiješajte na sobnoj temperaturi.Centrifugirajte na 8000 o/min nekoliko sekundi prije upotrebe;izračunati potrebnu količinu reagensa, a reakcioni sistem se priprema kao što je prikazano u sledećoj tabeli:
| Komponente | N porcija (25µl sistem) |
| nCOV prajmer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcijski rastvor | 2 µl × N |
| *N = broj testiranih uzoraka + 1 (negativna kontrola) + 1 (nCOVpozitivna kontrola) | |
2.2 Nakon temeljnog miješanja komponenti, centrifugirajte kratko vrijeme da sva tečnost sa zida epruvete padne na dno epruvete, a zatim alikvot sistema za amplifikaciju od 20 µl u PCR epruvetu.
3 Uzorkovanje (područje za pripremu uzoraka)
Dodajte 5 μl negativne i pozitivne kontrole nakon ekstrakcije.RNK uzorka koji se testira dodaje se u PCR reakcijsku epruvetu.
Čvrsto zatvorite epruvetu i centrifugirajte na 8000 o/min nekoliko sekundi prije nego što je prenesete u područje detekcije pojačanja.
4 PCR amplifikacija (pojačano područje detekcije)
4.1 Postavite reakcionu epruvetu u ćeliju za uzorke instrumenta i podesite parametre na sledeći način:
| pozornici | Ciklus broj | Temperatura(°C) | Vrijeme | zbirkasite |
| Obrnutotranskripcija | 1 | 42 | 10min | - |
| Pre-denaturacijan | 1 | 95 | 1min | - |
| Ciklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | prikupljanje podataka |
Odabir kanala za detekciju instrumenta: Odaberite kanal FAM、HEX、CY5 za fluorescentni signal.Za referentnu fluorescentnu NONE, molimo nemojte odabrati ROX.
5 Analiza rezultata (Molimo pogledajte eksperimentalne upute za svaki instrument za podešavanje)
Nakon reakcije, sačuvajte rezultate.Nakon analize, podesite početnu vrijednost, krajnju vrijednost i graničnu vrijednost osnovne linije prema slici (korisnik se može podesiti prema stvarnoj situaciji, početna vrijednost se može postaviti na 3~15, krajnja vrijednost se može postaviti na 5~20, podešavanje) u logaritamskom grafikonu Na pragu prozora, linija praga je u logaritamskoj fazi, a kriva pojačanja negativne kontrole je prava linija ili ispod linije praga).
6 Quauty kontrola (Proceduralna kontrola je uključena u test) Negativna kontrola: Nema očigledne krivulje pojačanja za FAM, HEX, CY5 kanale detekcijen
COV pozitivna kontrola: očigledna kriva pojačanja FAM i HEX kanala detekcije, Ct vrijednost≤32, ali nema krivulje pojačanja CY5 kanala;
Gore navedeni zahtjevi moraju biti ispunjeni istovremeno u istom eksperimentu;u suprotnom, eksperiment je nevažeći i treba ga ponoviti.
7 Određivanje rezultata.
7.1 Ako nema krivulje amplifikacije ili vrijednosti Ct > 40 u FAM i HEX kanalima testnog uzorka, a postoji krivulja amplifikacije u kanalu CY5, može se procijeniti da ne postoji novi koronavirus iz 2019. (2019-nCoV) RNK u uzorku;
.2 Ako test uzorak ima očigledne krivulje amplifikacije u FAM i HEX kanalima, a vrijednost Ct je ≤40, može se ocijeniti da je uzorak pozitivan na novi koronavirus iz 2019. (2019-nCoV).
7.3 Ako ispitni uzorak ima jasnu krivu pojačanja samo u jednom kanalu FAM ili HEX, a vrijednost Ct je ≤40, a u drugom kanalu nema krive pojačanja, rezultate je potrebno ponovo testirati.Ako su rezultati ponovnog testiranja konzistentni, uzorak se može ocijeniti kao pozitivan na novi
korona virus 2019 (2019-nCoV).Ako je rezultat ponovnog testiranja negativan, može se ocijeniti da je uzorak negativan na novi korona virus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivna vrijednost prosuđivanja
Metoda ROC krivulje koristi se za određivanje referentne CT vrijednosti kompleta, a referentna vrijednost interne kontrole je 40.
Interpretacija rezultata ispitivanja
1. Svaki eksperiment treba testirati na negativne i pozitivne kontrole.Rezultati ispitivanja mogu se utvrditi samo kada kontrole ispunjavaju zahtjeve kontrole kvaliteta
2. Kada su FAM i HEX kanali detekcije pozitivni, rezultat iz CY5 kanala (interni kontrolni kanal) može biti negativan zbog konkurencije sistema.
3. Kada je rezultat interne kontrole negativan, ako su FAM i HEX kanali detekcije epruvete takođe negativni, to znači da je sistem onemogućen ili je operacija pogrešna, t test je nevažeći.Stoga je potrebno uzorke ponovo testirati.
